[실험레포트] HPLC를 이용한 soft drink의 caffeine 분석

 

1. 실험 목표

• 역상 크로마토그래피를 이용하여 soft drink에 함유된 caffeine을 분석한다.
• 정지상으로 c18 컬럼을, 이동상으로는 water/MeOH을 선택하여 caffeine을 분리하고, UV 검출기를 이용하여 이를 검출한 뒤 soft drink 내의 caffeine을 정량한다.

2. 실험 이론 및 배경

크로마토그래피의 기본 개념

특성에 따라 고정상(stationary phrase, 평면,종이,얇은 막 크로마토그래피)과 이동상(mobile phase, 기체,액체 크로마토 그래피)으로 나눌 수 있다. 시료의 특징에 따라 통과하는 속도가 달라진다. 즉, 물질들의 화학적 상호작용 차이를 이용해 혼합물을 분리하는 물리적 분석방법이다. 고정상(정지상)은 다시 Column Chromatography, Planar Chromatography, paper Chromatography, Thin-layer Chromatography 그리고 이동상은 Liquid Chromatography 그리고 Gas Chromatography로 나뉘는데 이번 실험에서는 Liquid Chromatography인 Column Chromatography를 사용한다.

비교항목	정상	역상
고정상 극성정도	극성	C18 Column
이동상 극성정도	비극성	water/methanol
시료의 용리 순서	극성 소  → 대	극성 대 → 소
소요되는 분석 시간 (용매의 극성의 증가에 따라)	짧은 분석 시간	긴 분석시간
대상 시료	극성시료	Caffeine

GC(Gas Chromatography)	LC(Liquid Chromatography)
1. 고감도의 분석 가능(ppm, ppb) 2. 분석시간이 빠르며 시료의 주입량이 적음  3. 시료의 휘발성을 사용하므로 휘발성이 있어야 함 4. 열에 불안정한 물질은 분석이 어려움 5. 상대적으로 작은 분자(분자량<500)의 분석에 용이함	1. 상온에서도 분리가능 2. 열에 불안정한 물질도 분석가능 3. 분석 시료의 분자량 제한이 없다 4. 시료의 용해성을 사용하므로 시료를 잘 녹이는 이동상을 사용 5. 상대적으로 낮은 감도

 

HPLC

High Performance Liquid Chromatography(고성능 액체 크로마토그래피)

정지상과 이동상 사이에서 평형을 이루는 속도를 칼럼, 충전제, 장치의 개선을 통해 증가시킨다. 보통의 LC에서 입자를 더욱 작게하고, 가는 분리관과 고압펌프를 사용하여 용매를 흘린다.

일반 크로마토그래피와 마찬가지로 이동상과 고정상에 대한 밀접한 차이를 가지는 구성물질들로 이루어진 혼합물을, 구성물질간의 이동 속도 차이를 이용해 분리해내어 분리한 물질을 검출기를 통하여 검출해 내는 장치이다. 일반 크로마토그라피와 다른 점이 있다면, 일반 크로마토그래피는 삼투압이나 중력을 이용하여 이동상(mobile phase)과 구성물질을 이동시킨다면, HPLC는 pump를 이용해 가하는 압력으로 구성물질을 이동시킨다는 것이다. 또한 그냥 육안으로 관찰하는 일반 크로마토그라피와는 달리 UV detector등의 다양한 detector를 이용하여 용질을 확인하는 것도 차이점이다. Column안에 정제된 혼합물이 삽입되면, 혼합물 안의 구성물들은 고정상(stationary phase)과의 상호작용 때문에 column 안을 다른 속도로 이동하게 된다. 특정 구성물질이 이 column을 완전히 통과하는데 걸리는 시간을 retention time이라고 칭한다. 일정한 상태(온도, 염도 등)에서 동일한 물질의 retention time은 항상 동일하다고 본다. column 내의 고정상들은 대게 bead로 이루어져 있으며, 이 bead의 입자가 작을수록 크로마토그래피의 정밀도를 높인다. 또한 정밀도가 높을 수록 더 적합한 pressure, backpressure을 사용할 가능성이 높아진다. 대부분의 이동상은 수용성 용매로 물이 주로 쓰이고, 그에 대칭되는 유기용매로써 메탄올이나 아세토나이트릴이 많이 쓰인다. 수용성 용매에는 혼합물이 서로 분리되는 것을 돕기 위해 염이나 산을 약간씩 넣어주는 경우가 많다. 이동상의 구성은 일정하거나(isocratic elution mode) 변화하는데(gradient elution mode) 등용매 용리는 대체적으로 분석시간이 길고, rt가 큰 물질은 피크가 넓게 나와 분해능과 감도가 떨어지는 단점이 있다. 반면, 기울기 용리는 컬럼으로부터 성분의 용리를 빨리 하게 만들어 더 정밀하고 빠르게 극미량의 물질도 분리해낼 수 있다. 하지만, 너무 강한 기울기 용리는 분해능을 떨어트리기도 한다. 보통의 gradient elution mode는 역상크로마토그래프에서 아세토나이트릴 5%에서 시작해 95%까지 늘리는 방법을 사용한다.

• 용매(Eluent):용매의 점도는 낮아야한다. 두 가지 이상의 용매를 혼합해서 사용하는 경우 miscibility number가 1 미만이어야 한다. 분리를 위해서 용매는 컬럼속의 충진물을 녹여서는 안된다. 분석 대상 물질은 반드시 용매에 녹아야한다. 용매의 UV cutoff, reflective index값은 낮아야 한다. 분석 대상 물질과 반응성이 있거나 고정상과 반응성이 있는 용매의 사용은 피해야 한다.
• 이동상 전달 장치(pump): 용매 저장 용기에서 용매를 흡입하여 시료 주입기에서 검출기에 이르는 전 기기 부분에 밀어주는 역할을 한다. 얼마나 일정하고 재현성있는 유속으로 용매를 전달하는가에 따라 펌프의 성능이 평가된다. 용매 흐름의 요동으로 인한 노이즈를 줄이기 위해서는 용매를 일정한 압력으로 전달하는 고압펌프를 사용한다. 호스 내의 가스를 제거한 후에 용매 주입해야한다.(pump의 PRIME/PURGE valve를 이용) 펌프 내부는 용매와의 화학적 반응이 없어야하고, 0.1 ~ 10 mL/min 범위의 유속 구간이어야 한다.
• 시료주입기(Injector): 용매가 이동하는 경로에 분석하고자 하는 물질을 주입시키는 역할이며, 고정된 부피의 루프를 가지고있어서 안정적이게, 일정하고 정확한 양의 분석물질을 주입하기위해 그리고 높은 압력을 일정하게 유지하기 위해 사용한다. 
• 컬럼(Column): 관 모양의 용기에 충진제가 채워진 형태로 되어 있으며, 충진물, 시료, 용매의 상호 작용에 의해 혼합물 속의 분석 대상 물질을 분리하는 역할을 한다.
• 검출기(Detector): 컬럼을 통과한 용매와 시료는 지속적으로 전 시스템을 통해 흐르게 된다. 컬럼에서 분리된 성분은 시간간격을 두고 나오게 된다. 이때 검출기는 분석대상물질을 농도에 비례하는 전기적 신호로 바꾸어주게된다. 이 신호의 크기가 시료를 정량하는 척도가 된다. 이상적인 검출기는 감도가 높아야 하며, 농도가 넓은 범위에서도 신호의 세기의 변화가 직선적으로 변해야한다. 검출기의 종류로는 자외선-가시광선 검출기(UV-VIS detector), 형광 검출기 (Fluorescence detector) 그리고 굴절률 검출기 등이 있다. 이번실험에서는 자외선-검출기를 사용하게 된다. 자외선-가시광선 검출기는, 광원으로부터 특정 파장의 빛이 시료에 투사되면 특정 파장의 빛에대한 시료의 흡광도가 높은경우에는 시료를 투과하는 빛의 강도가 상대적으로 작아짐을 이용하여 전기적 신호로 나타낸다. 물질의 농도에 따라 빛의 투과성이 변화하는 램버트 비어의 법칙을 이용하여 ppm 범위로 용액 내 성분의 양을 측정한다. 흡수파장은 물질마다 차이가 있기 때문에 HPLC를 통해 뭘 분석하느냐에 따라 어떤 파장의 빛을 사용할지가 결정된다. UV검출기는 단일파장 혹은 지정된 몇 개의 파장만을 측정하는 흡광도 검출기와 지정된 범위의 스펙트럼을 스캔하는 DAD로 분류한다. 보통 정량분석에 이용하지만, UV스펙트럼은 물질 고유의 특성이기 때문에 검출된 성분과 표준물질의 UV스펙트럼을 비교하여 정성분석도 어느정도는 가능하다.

• 결과 처리 장치(Data system) : 검출기에서 나온 신호 값을 y축, 시간을 x축으로 하여 크로마토그래피를 그린다. 이때 그려진 크로마토그램 상의 피크면전이나 높이를 이용하여 각 물질의 양을 정량 분석한다.

장점	단점
1.휘발성이 문제가 되지 않아 분자량이 큰 물질도 분석이 가능하다. 2.열에 약한 물질도 분석이 가능하다. 3.기존 LC에 비해 감도가 좋다.	1.상대적으로 속도가 느리다. 2.감도가 GC보다 떨어진다. 3.분석대상물질이 용매에 용해되어야 한다.

 

van Deemter equation

컬럼과 유속이 단높이에 어떻게 영향을 끼치는지 설명하는 식이다.

u= 선형 유속

A,B,C - 칼럼과 정지상에 대한 상수

A= 다통로(multiple path) : 이동상, 고정상에서의 다중경로, eddy diffusion

B= 세로 확산(longitudial diffusion) : 띠 중심으로부터 칼럼의 축을 따라 일어나는 확산

C= 질량이동(mass transfer) : 용질이 이동상과 정지상 사이에서 평형을 이루는데 소요되는 일정 평형 시간

3. 실험 방법

 

카페인 1000ppm 용액 제조

1. 저울을 이용해 카페인 0.01g을 측정한다.
2. Mass cylinder으로 증류수 10mL를 측정한다.
3. 카페인 0.01g과 증류수 10mL를 넣고 잘 섞어 카페인 1000 ppm 용액을 만든다.

MeOH/water 용액 제조

1. Mass cylinder을 이용해 증류수 40mL를 측정한다.
2. Mass cylinder을 이용해 Methanol 60mL를 측정한다.
3. 증류수 40mL와 Methanol 60mL를 잘 섞어 MeOH/water (60/40(v/v)용액을 만든다.

표준용액 제조

1. 앞서 제조한 카페인 1000 ppm 용액과 MeOH/water 용액을 micro pipet과 mass cylinder를 사용하여 묽혀, 25 ppm 표준 용액을 만든다.
2. 같은방법으로 50ppm, 75ppm, 100ppm 표준용액을 제조한다.

실험 1. 카페인 표준물의 크로마토그램

1. 컴퓨터-HPLC 기기-Detector-Data Module 순으로 전원을 켠다.
2. Detector의 영점 버튼을 누르고, wavelength 설정 값은 275nm가 되도록 한다.
3. pump flow의 시작 버튼을 누른다.
4. 컴퓨터의 프로그램을 시작하여 새 크로마토그램 파일의 수집정보를 입력한다.
5. MeOH/water 용액을 5~10분간 컬럼 속으로 흘려주면서 검출기의 바탕선이 안정화되도록 한다.
6. 100ppm 표준 물질 20 uL를 LC syringe를 이용해 HPLC에 주입한다.
7. SYRINGE를 INJECTOR에서 뺴는 즉시 프로그램의 수집 시작 버튼을 눌러 피크를 얻는다.
8. 크로마토그램의 피크 면적을 기록하고 이 과정을 최소 3번 이상 반복한다.
9. 다음 용액 주입에 앞서 load 모드에서 MeOH/water 용액을 여러번 주입하여 세척한다.

실험 2. 음료 속의 카페인 분석

1. 홍차와 커피를 준비한다.
2. 각각의 soft drink 2mL를 mass cylinder에 담는다.
3. MeOH/water 용액을 이용해 soft drink를 1/3으로 희석한다.
4. Syringe filter를 이용하여 홍차와 커피의 불순물을 제거한다.
5. 커피 20uL를 LC syringe를 이용해 HPLC에 주입한다.
6. Syringe를 injector에서 빼는 즉시 프로그램의 수집 시작 버튼을 눌러 피크를 얻는다.
7. 실험 1과 마찬가지로 최소한 3회 이상 반복 측정한다.

 

4. 주의 및 참고사항

1. Microsyringe를 이용해 injector에 시료 주입 시 바늘 끝이 휘지 않도록 한다.
2. 시료를 취하는 주사기는 언제나 세척이 되어야 하며, 특히 injector에 주입 시 상호간에 오염이 되지 않도록 해야 하며, syringe 끝에 시료가 묻지 않게 잘 닦어주어야 한다. 시료 주입 전후에 용매를 이용하여 여러 번 세척을 한다.
3. 시료를 취하는 과정에서 기포가 syringe안으로 주입되지 않도록 주의한다.
4. 최초 실험 시, 검출기를 지난 waste 라인에서 이동상이 잘 흘러나오는지 확인하며 펌프의 압력을 확인한 후 막힌 곳이 있는지 확인한다.
5. Syringe는 쉽게 파손될 수 있으므로 취급에 유의한다.
6. 시료 주입 후 syringe를 뺄 때, 공기가 들어가지 않도록 Inject 상태에서 빼주어야한다. Load 상태에서 뺄 경우, Inject로 돌리기 전에 공기가 들어가 실험 결과에 큰 영향을 미친다.
7. 표준물질을 주입하고 난 후 레버를 inject 상태로 돌린 다음 syringe를 injector에서 빼는 즉시 프로그램의 분석 시작 버튼을 눌러야 한다.

 

5. 참고문헌

• 분석화학 실험 2판 (대한화학회 분석화학, 전기화학분과, 사이플러스)
• 화학공학실험 (성기천 外 2, 사이텍미디어)
• 화학공학개론 (김학준 , 문운당)
• 최신분석화학 (박정학外4명공역, 자유아카데미)

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https://www.happycampus.com/report-doc/26080530/