[실험레포트] Glucose oxidase를 이용한 glucose의 ampermetric 검출

 

1. 실험목표 

 

Glucose oxidase가 고정된 효소 전극에서 전류법을 사용하여 glucose를 정량 분석한다.

 

2. 실험 이론 및 배경

 

전류법(Amperometry)

 

• 전류법은 작업전극에 일정한 전위를 가하여, 전류 또는 전류의 변화를 측정하는 방법이다.
• 측정되는 전류는 전기화학종의 농도에 의존한다.
• 단계적으로 시약을 투입하므로 전류는 계단식으로 그래프에서 나타나게 된다.

amperometry graph

다음과 같은 장점이 있다.

• 전류법은 가하는 전위차에 따라서 특정 전기화학종의 반응성은 극대화하고, 다른 화학 종의 간섭을 감소시킬 수 있다.
• 감도가 매우 우수해 10^-5M 이하의 농도에서도 검정곡선을 얻을 수 있다.
• 전위차법보다 빠른 전극 감응시간을 가진다.
• 검정곡선의 그래프가 직선형이어서 검출한계를 알아내기 용이함
• 화학 반응의 생성물이 전기 화학 종이어도 이용 가능해 확장성이 좋다.

물질의 이동과정

 

1. 농도 기울기에 따른 확산(diffusion) 용액 속 물질의 농도 차에 의한 확산 때문에 발생하는 전류를 diffusion current라고 한다.
2. 전위 기울기에 의한 이동(migration)전하를 띠는 물질이 전극으로 이동하는 것이다. 이를 억제하기 위해 전하가 고루 퍼진 buffer를 사용한다.
3. 용액의 대류 (convection)온도나 밀도 차에 의한 대류와 stirring 등의 조작에 의한 이동이 발생하는 것이다.  

전기분해 (Electrolysis)

 

• 자발적으로 산화-환원반응이 일어나지 않을 때 전기에너지를 이용하여 비자발적인 반응을 일으키는 것을 전기분해라고 한다. 
• 전기분해시에 -극에서 +이온이 환원되고, +극에서 -이온이 산화된다.
• 이 실험에서 glucose와 glucose oxidase의 반응에 이 방법이 이용된다.

삼전극계 (Three Electrode System)

 

• 작업전극 (working electrode) : 실제적인 반응을 보고자 하는 전극이다.
• 상대전극 (counter electrode) : 전체 회로가 완성될 수 있도록 하는 전극이며 작업전극과 짝을 이룬다.
• 기준전극 (reference electrode) : 작업전극에 걸리는 전위의 기준을 잡아준다.

효소 (Enzyme)

 

• 아주 높은 효율로 특정 화학반응에서 촉매작용을 하는 단백질을 통칭한다.
• 효소의 활성도는 온도와 pH의 영향을 받으며 특정 기질에만 작용한다. (특정 기질의 정량분석에 유용함)
  
  

효소 전극 (Enzyme Electrode)

 

• 효소를 전기화학 반응에 활용하기 위해 불용성 지지체(matrix)로 전극에 고정하는 과정이 필요하다. 이러한 과정을 거치면 물리,화학적 변화를 전기신호로 변환하여 기질의 양을 검출할 수 있다.
• 장점 : 연속적인 반응에 이용할 수 있다. 또 외부 조건의 변화에 대한 효소의 민감성이 감소된다.
• 단점: 효소 반응의 효율성이 저하된다. 작용부위의 비활성화 발생이 가능하다.
• 이 실험에서는 자연적으로 소비된 산소 또는 생성된 과산화수소의 양을 측정하여 glucose의 농도를 검출하는 1세대 전극을 사용한다.
• 용액에서 glucose가 Nafion 막으로 선택적으로 확산하여 이동하고, glucose oxidase에 의해 H2O2가 생성된다. H2O2는 전극에서 산화되어 glucose의 양에 비례하여 산화전류를 발생시킨다.
  이때 glucose oxidase의 active site는 한정되어 있으므로 glucose의 양이 증가할수록 saturation이 발생하게 된다.

주의 및 참고사항

 

1. Glucose oxidase의 활성도가 유지되도록 늘 신선한 용액을 준비한다.
2. Glucose oxidase와 Nafion 막을 각각 준비하는 과정에서 충분히 건조 및 안정화 시간을 가져야한다.
3. H2O2와 glucose를 검출하는 실험에서는 각각의 용액을 고농도로 준비하고, 소량을 buffer 용액 내에 injection하여 원하는 농도를 맞추도록 한다.